Allgemein
Ziel des Themenschwerpunktes ist, zunächst einen umfangreichen Überblick über die pilzlichen Pathogene an ausgewählten Arzneipflanzen im Samen und an Blättern zu erhalten. Für relevante Pathogene soll anschließend eine sichere molekulare Nachweismethode etabliert werden. Zudem werden mögliche alternative Bekämpfungsverfahren/-strategien gegen ausgewählte Erreger untersucht. Dabei stehen Untersuchungen der Pathogene an Anis (Pimpinella anisum) und Johanniskraut (Hypericum perforatum) im Vordergrund.
Phytopathogene Pilze
Es gibt eine Vielzahl von Organismen, die an Pflanzen Krankheiten auslösen können. Hierzu zählen Bakterien, Viren, Pilze und Nematoden. In der Regel können mehrere Krankheitserreger an einer Kultur vorkommen. Die Pathogene infizieren über Wunden, Spaltöffnungen, Hydathoden oder dringen direkt durch die Epidermis in die Pflanze ein. Pilzliche Pathogene können sich inter- und intrazellulär im Blattgewebe ausbreiten und entziehen den Wirtspflanzen Nährstoffe.
Nach der Infektion können sich in Abhängigkeit von der Wirt-Pathogen-Kombination unterschiedliche Symptome entwickeln z. B. Chlorosen und Nekrosen, die zum Teil stark ausgeprägt sein können und entsprechend zu massiven Schädigungen der Pflanzen führen. So kann massiver Befall zu einem Totalausfall der Ernte führen. Weiterhin können phytopathogene Pilze toxische Sekundärmetabolite produzieren, die gesundheitsschädlich für die Verbraucher sein können [1–3].
Die Verbreitung von pilzlichen Pathogenen erfolgt zumeist über Sporen, die durch Wind und Regen oder anderen Organismen übertragen werden [1, 3]. Die Erreger können an Ernterückständen z. B. mittels Dauersporen über mehrere Jahre im Boden überdauern und einen Anbau über mehrere Jahre verhindern [3]. Ein Anbau der Kultur einer derart kontaminierten Fläche würde zu einem erneuten Ausbruch der Krankheit und eine Anreicherung der Pathogene im Boden führen, was durch eine weitere Fruchtfolge vermieden werden könnte.
Der Klimawandel hat eine Auswirkung auf Pathogene [4]. Auf Grund steigender Temperaturen und Trockenperioden können sich neue Pathogene aus wärmeren Gebieten in Deutschland zunehmend etablieren. Zudem können diese Pathogene neue Wirtspflanzen infizieren. In beiden Fällen kommt es zu neuen Wirt-Pathogen-Kombinationen, deren Relevanz für den Anbau der Kulturen nicht bekannt ist und unbedingt untersucht werden müssen. Auch durch den Klimawandel vermehrt auftretende Starkregenereignisse fördern den verstärkten Befall mit Feuchtigkeit liebenden Pathogenen z. B. Falscher Mehltau, der ebenfalls zu starken Ertragsverlusten führen kann.
Übersicht über pilzliche Pathogene an Anis und Johanniskraut
Pilzliche Phytopathogene sind für alle Arzneipflanzen beschrieben. Der Schwerpunkt in diesem Themenschwerpunkt liegt bei den Kulturen Anis (Pimpinella anisum) und Johanniskraut (Hypericum perforatum). Es können z. B. Blattfleckenkrankheiten (Alternaria spp., Stemphylium spp.), Fuß- und Welkekrankheiten (Verticillium spp., Colletotrichum spp., Fusarium spp.), Grauschimmel (Botrytis cinerea), Echter und Falscher Mehltau (Erysiphe hyperici, Plasmopara pimpinellea) sowie Rost (Puccinia pimpinellea) auftreten [5–10]. Um einen aktuellen Überblick der auftretenden Pathogene an bzw. in Samen und Blättern zu erhalten, wurde die klassische Methode der Kultivierung auf Nährmedien angewandt. Dafür wird Pflanzenmaterial (Blätter, Stängel, Samen) nach Reinigung und Oberflächendesinfektion auf Nährmedium ausgelegt [11]. Von ausgewachsenen Pilzen (Abbildung 1) werden Reinkulturen gewonnen (Abbildung 2), die morphologisch und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die gewonnenen Isolate sind zur langfristigen Aufbewahrung in eine Pathogenbank aufgenommen worden.
Molekularbiologischer Nachweis von samenbürtigen Pathogenen
Bei Auftreten von Symptomen z. B. Verfärbungen oder nekrotischen Flecken an der Pflanze, kann ein Befall von Pathogenen häufig bereits makroskopisch festgestellt werden. Bei Samen ist der Befall meist durch das bloße Auge nicht erkennbar. Jedoch ist für eine erfolgreiche Kulturführung gesundes pathogen freies Saatgut eine Grundvoraussetzung. Um eine Aussage über den Schaderregerbefall an Samen treffen zu können, muss eine Saatgutüberprüfung durchgeführt werden. Für Arzneipflanzen gibt es keine speziellen Vorschriften der ISTA (Internationale Vereinigung für Saatgutprüfung) wie es für die großen Ackerbaukulturen der Fall ist, die validierte Standard-Protokolle für die Überprüfung des Saatgutes vorgeben. Nur durch den sicheren Nachweis von pilzlichen Pathogenen im Saatgut ist es aber möglich, gesundes Saatgut zur Verfügung zu stellen.
Der Nachweis von samenbürtigen Erregern erfolgt häufig auch mittels der klassischen Methode die eine Oberflächensterilisation und das anschließende Auslegen der Samen auf Nährmedium beinhaltet [11]. Dieses kultivierungsabhängige Verfahren ist mit einem hohen Arbeits- und Zeitauswand verbunden. Molekularbiologische Nachweisverfahren haben dagegen einen wesentlich geringeren Aufwand. Daher soll in diesem Themenschwerpunkt ein Nachweisverfahren mithilfe der quantitativen Real-Time PCR (qPCR) etabliert werden, wodurch Pathogene direkt im Samen nachgewiesen und quantifiziert werden können. Bei der qPCR wird der Pilz mithilfe von artspezifischen Primer und einer TaqMan-Sonde nachgewiesen. Dabei ist ein weiterer Vorteil gegenüber der klassischen Methode, dass die Nachweisgrenze für das Pathogen deutlich niedriger liegt als bei der kultivierungsabhängigen Methode [12]. Ein weiterer Vorteil stellt die Möglichkeit zur Quantifizierung des Erregers dar.
Als Zielorganismus in diesem Projekt wurde der Erreger der Johanniskrautwelke Colletotrichum gloeosporioides (teleomorph Glomerella cingulata) ausgewählt, der zu massiven Ernteausfällen führen kann und eine der wichtigsten Krankheiten von Johanniskraut darstellt. Weltweit führt C. gloeosporioides zu Ernteverlusten auch an anderen Kulturen [13–16].
Lokalisierung der Pathogene im Samen
Neben dem Nachweis von samenbürtigen Erregern ist auch die Lokalisierung des Erregers am/im Samen ein wichtiges Kriterium für die Entwicklung von Bekämpfungsverfahren. Die Erreger können sich sowohl auf der Samenschale als auch unter der Samenschale befinden oder können in den Embryo eingewachsen sein. Die spätere Bekämpfung der Erreger richtet sich nach ihrer Lokalisierung. Ein Befall direkt unter der Samenschale kann anderes bekämpft werden, als ein Befall im Embryo. Mittels histologischer Untersuchungen von infiziertem Saatgut soll diese Lokalisierung ermöglicht werden. Erste Ergebnisse zur Lokalisierung von C. gloeosporioides an artifizielle infizierten Johanniskrautsamen wurden von U. Gärber erarbeitet [17]. In dieser Arbeit sollen abschließende Untersuchungen zur Lokalisierung des Pathogens erfolgen. Dazu wird das Saatgut in kaltpolymerisierenden Kunststoff eingebettet. Anschließend werden Dünnschnitte mit einer Dicke zwischen 8-12 µm angefertigt und speziell eingefärbt, um die Pilzstrukturen besser sichtbar zu machen. Durch eingefärbten Dünnschnitte des Samens ist eine Lokalisation des Erregers in der Samenschalen bzw. Embryo möglich. Während Einbettmethoden für Blattmaterial problemlos anzuwenden sind (Abbildung 3), erschwert die harte Samenschale die vollständige Infiltration des Samens mit dem Kunststoff [18], welches beim späteren Schneiden des Samens zum Verlust des Embryos führt. Daher soll zunächst das Protokoll zur Sameneinbettung für Johanniskrautsamen optimiert werden.
Bekämpfung von Blattpathogenen mittels biologischer Pflanzenschutzmittel
Basierend aus den Ergebnissen des Pathogenscreenings sowie des Nachweises und der Lokalisierung der Pathogene sollen unterschiedliche Bekämpfungsstrategien getestet werden. Hier sollen vor allem alternative Pflanzenschutzmaßnahmen mit biologischen Pflanzenschutzmitteln zum Einsatz kommen. Der besondere Fokus liegt dabei auf den sog. „Low Risk"-Produkten, die nur einen sehr geringen Einfluss auf die Umwelt haben und unschädlich für die Anwendenden sind. So ist geplant, unterschiedliche mikrobiologische Präparate auf ihre Wirksamkeit gegenüber ausgewählten Pathogenen zu untersuchen. Zudem sollen unterschiedliche pflanzliche Extrakte und ätherische Öle, die im Rahmen des Projekts von den Partnern (JKI, Berlin-Dahlem) zur Verfügung gestellt werden, auf ihre hemmende Wirkung auf ausgewählte Phytopathogene in vitro und ad planta getestet werden. Pflanzliche Extrakte, z. B. von Süßholz, zeigten neben einer bakteriziden auch eine fungizide Wirkung [19]. Auch für ätherische Öle unterschiedlicher Pflanzen wurde bereits eine inhibitorische Wirkung gegen Pilze beschrieben [20, 21]. Durch Verwendung dieser Naturstoffe soll eine nachhaltige Pflanzenschutzstrategie entwickelt werden.
Literatur
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